Методы биохимических исследований - ABCD42.RU

Методы биохимических исследований

Методы биохимических исследований

Биохимические анализаторы являются важным и необходимым шагом в развитии современных клинико-биохимических исследований. Диагностические исследования, проводимые с непосредственным участием лаборанта, могут значительно отклоняться от действительности из-за неизбежных ошибок при работе с большим числом образцов. Исследования с использованием анализаторов отличаются от стандартных ручных методов высокой надёжностью, большей точностью, экономичностью и эффективностью, что обеспечивает возможность быстрой постановки правильного диагноза [1].

Первым толчком к развитию биохимических анализаторов послужило создание фотометров и спектрофотометров с контролируемой температурой кюветы. Это позволило осуществить на практике принцип кинетического исследования субстратов и ферментов. В дальнейшем в устройства была заложена электронная функция автоматического перевода регистрируемых значений в показатели концентрации или активности. Исключение из процесса оператора позволило проводить исследования в режимах:

• фиксированного времени (измерение результата через определенный интервал времени после начала реакции);

• кинетики (ряд измерений с определенным интервалом времени и расчетом активности фермента по средней величине изменения абсорбции за этот интервал времени);

• дифференциальном (расчет концентрации по разности абсорбции опытного и контрольного образцов);

• бихроматическом (расчет концентрации по разности абсорбции, измеренной на двух длинах волн).

Важную роль играет качество исполнения самого анализатора, неразрывно связанное как со стоимостью прибора, так и его обслуживания. Анализаторы «закрытого» типа имеют наиболее высокую точность измерения, но только при использовании в них предписанных производителем реагентов. Анализаторы «открытой» системы предоставляют возможность использования реагентов любых производителей, но при этом, ни изготовитель анализатора, ни изготовитель реагентов не дает гарантий получения корректных результатов для каждого конкретного варианта совмещения анализатора и реагентов.

Биохимический анализатор может обеспечивать выполнение различных тестов и анализов: от срочных до традиционных клинико-биохимических. Данные аппараты делят на автоматические, полуавтоматические и спектрофотометры. Автоматические выполняют большой спектр операций: отбор материалов и реагентов, их смешивание и нагрев, анализ, обработку и печать полученной информации, автоматическое промывание прибора. На полуавтоматических анализаторах процесс подготовки анализируемых веществ оператор производит вручную, что крайне неудобно для крупных лабораторий. Для более быстрой и удобной работы системы биохимические анализаторы могут быть оснащены: автоматическими манипуляторами, центрифугами для пробирок, специальным программным обеспечением для обработки результатов пациентов.

Полуавтоматические биохимические анализаторы осуществляют автоматическую калибровку, выдают запрос о необходимости добавления последующей пробы. Вычисление результатов исследования происходит по выбранному оператором алгоритму и отображается на дисплее прибора. В некоторых модификациях приборов предусмотрены дополнительные опции, позволяющие производить сравнения результатов и определить их соответствие по бланку, изменению оптической плотности или значению. Возможно несколько вариантов предоставления информации: в электронном виде (вывод результатов на экране монитора либо сохранение на записывающем устройстве), печать на бумаге. При использовании полуавтоматического анализатора лаборанту необходимо самостоятельно приготовить пробу и подготовить реагент. Полуавтоматический биохимический анализатор используется в «малых» лабораториях с производительностью до 200 тестов/час.

Автоматические биохимические анализаторы требуют крайне малого участия оператора. Оператор подбирает профиль работы прибора по аналогии с порядком установления параметров и количеством анализируемых проб. Контроль оператора нужен только на фазе программирования тестов и при определении «профиля» (регламента последовательности определения тех или иных параметров) и числа анализируемых проб. Все остальные действия по подготовке пробы осуществляются в автоматическом режиме. Основными качествами всех автоматических биохимических анализаторов являются: большая пропускная способность, малый (в сравнении с мануальными методиками и определением на полуавтоматических анализаторах) расход реагента, автоматическая подача и смешивание реагентов (в наиболее современных системах блок для хранения реагентов охлаждается). Большее количество автоматических системы оборудованы программным обеспечением, позволяющим оценивать точность результатов, кроме того, при получении неточного результата они позволяют повторить анализ с другим разведением пробы. Практически во всех приборах этого класса управление осуществляется при помощи внешнего компьютера или аналогичного современным компьютерным системам встроенного процессора [1, 2].

По работе с реагентами полностью автоматизированные анализаторы принято делить на так называемые «открытые» и «закрытые» системы.

Закрытый тип анализаторов предполагает применение ограниченного числа реагентов, предусмотренных разработчиком. В систему изначально добавлены контрольные и калибровочные данные, а информация о применяемых реагентах в данном конкретном исследовании заносится в прибор посредством считывания штрих-кода с их упаковки. Ограниченность выбора реагентов является минусом данного анализатора. Как правило, заявленные производителем реагенты достаточно дорогостоящие, заменить их более дешевыми аналогами нельзя, так как это может привести к некорректной работе самого анализатора. К плюсам анализатора данного типа можно отнести стабильность результатов калибрования.

Открытый тип анализаторов предполагает возможность применения реагентов практически любого производителя благодаря встроенному набору светофильтров для выполнения наиболее распространенных методик анализа. В целом работа систем открытого и закрытого типа одинакова. Стоит отметить, что не все системы открытого типа полностью похожи. Каждый производитель разрабатывает свои уникальные механизмы – блоки реагентов, блоки анализируемых образцов и т. д.

В основу работы лабораторного анализатора положен спектрофотометрический метод – изучение биологических жидкостей с помощью химических реакций и спектральных измерений. Точность, объективность анализов в сочетании с высокой производительностью – основные достоинства этого метода.

Автоматические биохимические анализаторы проводят весь процесс работы без вмешательств лаборанта: дозировку проб и реагентов; фотометрию, выведение данных на монитор компьютера и их перенесение на бумагу; промыв системы тоже происходит автоматически [2].

Из этого следует, что автоматические биохимические анализаторы выгодно отличаются от остальных типов: своей производительностью до 800 тестов/час; скоростью замера и обработки результатов: время одного замера составляет от 3 до 30 сек; минимальным расходом реагентов; точностью результатов.

Плюсы использования автоматического биохимического анализатора:

1. Требуют минимального участия оператора. Оператор выбирает профиль работы прибора в соответствии с порядком определения параметров и количеством анализируемых проб. Все остальные действия по подготовке пробы осуществляются в автоматическом режиме.

2. Высокая производительность, быстрота в обработке проб и результатов анализов.

3. Экономическая выгодность и быстрая окупаемость за счет минимального потребления реагентов, исследуемых материалов, электроэнергии за счёт автоматического смешивания, подачи реагентов и промывки системы.

4. Управление автоматическим биохимическим анализатором осуществляется посредством самого современного компьютерного оборудования, которое в зависимости от модели может являться неотъемлемой частью прибора, либо анализатор имеет возможность подключения к внешнему мощному компьютеру. Программное обеспечение адаптировано под работу с операционными системами Windows и DOS [3].

Методы спектрофотометрии основаны на том, что своими, характерными только для него, спектральными свойствами, обладает каждое вещество. Спектрофотометр- прибор, предназначенный для измерения отношений двух потоков оптического излучения, один из которых – поток, падающий на исследуемый образец, другой – поток, испытавший то или иное взаимодействие с образцом. Позволяет производить измерения для различных длин волн оптического излучения, соответственно в результате измерений получается спектр отношений потоков. Обычно используется для измерения спектров пропускания или спектров отражения излучения. Спектрофотометры, предусмотрены на регистрацию величины оптической плотности и производящие элементарные математические операции с полученными величинами, которые, в свою очередь, подразделяются на одно- и многоканальные системы. Между собой они отличаются по наличию (или отсутствию) ряда вспомогательных возможностей, таких как термостатирование пробы, автоматический вычет бланка, вывод результатов на дисплей или на печатную ленту и так далее. Приготовление реагентов, смешивание и внесение образцов, порядок очередности тестов для всех этих анализаторов проводится врачом-лаборантом вручную, поэтому используемые в этом случае методики называют «ручными» или «мануальными». С помощью спектрофотометра определяют состав и наличие примесей в различных жидкостях, таких как медицинские растворы, вода, продукты нефтяной и химической промышленности, продукция лакокрасочного производства [1, 4].

Все методы биохимического анализа имеют чёткие правила, выполнение которых позволяет определить правильный диагноз и увеличить производительность, что немаловажно. К ним относится правило минимального объема проб, которое позволяет повысить экономичность биохимического анализатора в целом. Кроме того, существует такой нюанс работы рассматриваемых приборов, как минимальный шаг дозирования, который также способен оказывать серьезное влияние на расход реагентов, а значит и экономическую эффективность анализатора. Более точная (с меньшим шагом) дозировка реагентов и образцов позволяет выдержать заданный регламент анализа, используя меньшее количество препаратов. В автоматизированных анализаторах присутствует проточная кювета, исключившая ошибки, связанные с постановкой кюветы в измерительный модуль и ее термостатированием, и позволяющей экономнее расходовать реактивы, поскольку при толщине поглощающего слоя 1 см объем кюветы составляет не более 100 мкл. С учетом объемов подводящих трубок и необходимости несколько раз менять реакционную смесь в кювете до начала измерения объем раствора, требуемый для проведения измерений, составляет 0,5–1,0 мл [4].

Принцип действия биохимического анализатора – с двух сторон отверстия находятся два независимых друг от друга электрода, когда клетка проходит через апертуру, появляется электрический импульс, регистрируемый специальным датчиком. Для установления степени концентрации тестируемых клеток через апертуру прогоняют через канал нужный объем пробы и производят подсчет образованных при этом импульсов. В некоторых случаях при подсчете импульсов осуществляется сбой и устройство выдает ошибочный результат. Это происходит, например, когда в одно и то же время в апертуре находится сразу две клетки. В этом случае анализатор фиксирует их как один электрический импульс. Чтобы не совершить подобной ошибки, делают разведение тестируемой пробы при помощи изотонического раствора определенной концентрации. Это позволяет достигнуть присутствия в канале устройства в нужный момент только одной клетки. Тем не менее, при недостаточном перемешивании дозы крови перед тестированием ошибка не исключается даже при верном разведении пробы. Данные анализа, выдаются в виде цифровых значений и дополнительного графического изображения.

Практически все современные анализаторы могут проводить исследования по конечной точке, а также регистрировать динамику фермент-субстратного взаимодействия, точно определять другие параметры, используя изначально заложенные или составленные в ходе исследования калибровочные кривые [5].

Помимо этого, некоторые модели анализирующих устройств открытого типа также оборудованы сканером штрих-кода, что позволяет таким же образом считывать информацию об используемых реагентах.

Читайте также  Роль алхимии в становлении химии

Таким образом, биохимический анализатор остается наиболее востребованной и неотъемлемой частью не только современной клиники, но экспериментальной биологической лаборатории.

Вывод: биохимические анализаторы абсолютно необходимы при проведении клинической диагностики, поскольку эффективность их работы в разы превышает эффективность диагностики, проводимой вручную. Стоит отметить такие моменты, как качество самих анализаторов, которое может значительно варьировать, связанную с качеством оборудования стоимость и необходимость правильного обслуживания аппаратуры. Эти критерии выступают как ограничители, препятствующие распространению как высококачественных анализаторов, так и аппаратуры такого рода в принципе. Опыт применения типовых анализаторов для лабораторий показал, что их введение имеет положительное значение, но зачастую эффективность оказывается ниже необходимого. Следовательно, выбор анализатора должен производиться с учётом специфики самого медицинского или исследовательского учреждения, а также условий, влияющих на его работу.

Методы измерения в клинической биохимии

Дылдин Д.Р. — директор ООО «Юнимед-Сервис»

Шибанов А.Н. — генеральный директор А/О Юнимед, член правления Ассоциации производителей средств клинической лабораторной диагностики, генеральный секретарь РАМЛД

Все измерения в клинической биохимии (как собственно и во всех других областях) выполняются прямым либо косвенным методом.

В первом случае проводится прямое измерение заданных аналитов.

При косвенном методе измеряется одна величина и пересчитывается в другую. При этом измеряемая величина должна иметь функциональную зависимость от рассчитываемой.

Для прямых измерений используются специальные датчики (или чипы), которые реагируют только на наличие того вещества, для поиска которых они созданы. Это могут быть ионоселективные датчики, датчики глюкозы, лактата, pH, датчики газов. Прямой метод является весьма точным и дешевым способом измерения. Однако, его недостаток состоит в том, что прибор, созданный для измерения какого-либо одного аналита не сможет измерять концентрацию других веществ, что сужает применение приборов данного типа. Для измерения концентрации, скажем, 30-40 веществ (а обычно столько методик и выполняют в лабораториях), необходимо столько же приборов.

Универсальность измерений обеспечивается устройствами, использующими косвенный метод измерения. К таким относятся программируемые и автоматические фотометры. В этом типе приборов реализован принцип фотометрирования, при котором регистрируют оптическую плотность и ее изменения.

Измерение концентрации белков, микроэлементов, ферментов, гормонов в биологических жидкостях осуществляется с использованием специальных наборов реагентов, при взаимодействии которых с соответствующими аналитами происходит измерение окраски реакционной среды, что регистрируется фотометрически.

Следует иметь в виду, что исследуемый материал должен быть оптически прозрачным посуда, в которой производится фотометрирование (в противном случае фотометрирование будет затруднено или вообще невозможно).

Еще сравнительно недавно в лабораториях для биохимических исследований применялись в основном достаточно простые фотометры (типа ФЭК, КФК и т.п.). В последнее время таких инструментов остается все меньше, но до сих пор и они еще встречаются. Измерения сопровождаются вычислениями (иногда довольно трудоемкими). От лаборанта требуется приготовить исследуемый образец, согласно требованиям того набора реагентов, который он собирается использовать, провести биохимическую реакцию, затем произвести фотометрирование, произвести необходимые расчеты и получить результат.

Следующим шагом в развитии приборного оснащения являются программируемые фотометры (приборы типа Stat Fax). Используя эти инструменты, заранее их запрограммировав на достаточно большое количество методик можно существенно ускорить работу. Однако и эти инструменты не выпадают из цепочки: исследуемая среда → измерительный прибор → результат. От качества пробоподготовки, проведения реакции и чистоты посуды существенно зависит точность результатов.

Автоматические биохимические анализаторы позволяют существенно ускорить и упростить процесс получения конечного результата. В этом инструменте проведение реакции (разведение исследуемого образца и реагента, выдерживание времени реакции) и фотометрирование производится автоматически. Роль лаборанта сводится к правильной пробоподготовке (приготовлению исследуемого материала) и загрузкой на борт прибора исследуемых образцов и реагентов. Однако и здесь есть некоторые подводные камни. Вся работа должна в точности соответствовать заданной методике (алгоритму выполнения приготовления реакционной смеси, регистрации и расчета) и попытки что-либо изменить в методике (обычно это делается с целью экономии либо времени, либо расходных материалов) приводит к негативным последствиям, как в точности измерений, так и работе прибора в целом.

Кроме того, при использовании косвенных методов измерения, следует помнить о том, что в самом принципе косвенного метода заложена определенная погрешность.

Поэтому для каждой методики указывается ее точность и воспроизводимость, что необходимо учитывать. Кроме того, в любом инструменте содержатся узлы (а в автоматах их очень много), которые требуют технического обслуживания (очистка, регулировка, замена изношенных деталей). Если этого не делать, то по мере износа прибора точность измерения будет снижаться, а достоверность измерений может вызывать сомнения. Это возникает вследствие износа дозирующих устройств, загрязнения оптического канала, люфтов подвижных устройств.

Фотометрирование в биохимии служит для определения искомого вещества в исследуемой среде и (или) вычисления его концентрации, либо активности, используя изменение окраски реакционной смеси (либо интенсивности окраски, т.е. ее оптической плотности). Как правило, фотометрирование производится на определенной длине волны, которая подбирается таким образом, чтобы поглощение света для данной реакционной смеси было максимальным.


Рисунок 1
. Принципиальная схема фотометрического анализа

Расчет результатов измерений производится в зависимости от типа реакции. В частности здесь будут рассмотрены методы расчета по конечной точке, кинетические, псевдокинетические и их производные. В каждом случае расчеты производятся по коэффициенту (фактору), по одному стандарту, либо по калибровочной зависимости сложного вида (мультистандартная калибровка).


Определение по конечной точке

После смешивания реактива и образца, начинается химическая реакция, которая сопровождается изменением оптической плотности (Abs). По истечении времени инкубации, которое задается в методике, реакция прекращается, и изменение оптической плотности также прекращается. Оптическая плотность становится более-менее постоянной величиной, пропорциональной концентрации искомого вещества. В этот момент и производится измерение оптической плотности.


Рисунок 2.

Остановимся на этом моменте подробнее.

При калибровке по стандарту, выполняется замер оптической плотности реакционной смеси, где концентрация искомого вещества заведомо равна нулю (бланк). Затем, измеряется оптическая плотность реакционной смеси, где концентрация искомого вещества известна с высокой точностью (калибратор или, как еще говорят – стандарт), и химическая реакция подошла к концу (т.е. время инкубации закончилось). Калибратор обычно прилагается к набору реагентов. Допустим, что 250 – это оптическая плотность бланка, 700 – это оптическая плотность стандарта. Получив эти величины, мы можем построить график, где на горизонтальной оси — концентрация, а по вертикальной – оптическая плотность, причем оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации.


Factor = сtg a
Рисунок 3.

Получив такой график, который называется калибровочным, измеряя оптические плотности последующих образцов (исследуемых), можно высчитать концентрацию искомого вещества.

При использовании калибровки по стандарту, расчет производится по следующей формуле:

При использовании современных инструментов фотометрирования (специализированных фотометров), концентрация высчитывается автоматически. При этом автоматически высчитывается фактор – пропорциональный углу наклона калибровочного графика по отношению к горизонтали (на самом деле высчитывается тангенс угла наклона).

Еще одна разновидность реакции по конечной точке – расчет по фактору.

В этом случае замеряется оптическая плотность бланка и по уже заданному фактору (который пропорционален углу наклона) производится измерение плотностей исследуемых образцов.

Формула для расчета будет следующей:

Еще одна разновидность конечно-точечной реакции – определение по сложной калибровочной кривой. Такая калибровочная зависимость применяется, когда интенсивность изменения окраски не прямо пропорциональна концентрации искомого вещества. В таких случаях используют несколько стандартов (до 9).


Рисунок 4.

Если говорить о современных методах исследований, то такая калибровка применяется чаще всего в методах иммунохимии.

Кроме всего, следует упомянуть о методах бихроматического фотометрирования. Этот метод является частным случаем метода по конечной точке. Вместо оптической плотности измеренной на одной длине волны, в расчете используется разность оптических плотностей, измеренных на двух длинах волн – основной и вспомогательной (часто в терминологии используется термин – дифференциальный). Такой метод определения используется, когда нужно «отфильтроваться» от помех, обусловленных оптическими свойствами емкости, в которой производится фотометрирование (например, цилиндрическая пробирка), мутностью исследуемого образца (а иногда и окраской).

Еще одним частным случаем метода определения по конечной точке является дифференциальный метод (метод с холостой пробой по образцу). При использовании этого метода на одном и том же исследуемом образце приготавливается две пробы – одна с неполной композицией реагентов (когда не происходит специфическое окрашивание образца), вторая с полной композицией реагентов, когда специфическое окрашивание происходит. Разница оптических плотностей этих двух проб пропорциональна концентрации исследуемого вещества.

Кинетические методы измерения

Кинетические методы измерения – это методы, когда изменения оптической плотности регистрируются во времени и измеряется скорость изменения, которая пропорциональна либо концентрации исследуемого вещества, либо активности этого вещества (например, ферментов).

Ниже показан типичный пример кинетического измерения.


Рисунок 5.

Расчет производится либо по фактору, либо по стандарту.

Активность ферментов обычно вычисляется по фактору:

Расчет с калибровкой по стандарту:

В случае калибровки по стандарту, расчет происходит по той же самой формуле, только здесь фактор не является параметром, заданным в методике на реагенты, а вычисляется по формуле:

Псевдокинетические методы измерения (двухточечная кинетика).

Здесь также определяется скорость изменения оптической плотности по времени реакции, только здесь измеряется оптическая плотность в начале интервала измерения (после ЛАГ-фазы) и в конце.

Методы биохимических исследований

В биохимии широко применяют диализ, центрифугирование, оптические методы, различные виды хроматографии и др.

Оптические методы

В основу абсорбционной спектроскопии положен принцип измерения поглощения света, проходящего сквозь раствор исследуемого вещества, вследствие его абсорбции. Измерение спектров осуществляют на специальных спектральных аппаратах, в которых пробу вещества помещают между источником света и фотоэлементом, регистрирующим свет. Каждое вещество имеет характерный свет поглощения. Для аналитических целей используют длину волны, соответствующую максимуму поглощения исследуемого соединения (λmax).

Фотоэлектроколориметрия – это измерение поглощения видимой части спектра окрашенными растворами.

Собственно спектрофотомерия – это измерение поглощения (пропускания) прозрачных растворов в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной зонах спектра (220-1100 нм).

Читайте также  Психологические особенности нехимических зависимостей

Нефелометрия – метод измерения интенсивности рассеянного света.

К приборы, базирующимся на измерении светопоглощения веществ, относятся фотоэлектроколориметры (ФЭК) и спектрофотометры (СФ). ФЭК позволяют проводить измерения поглощения в видимой части спектра. СФ дают возможность проводить измерения в широком диапазоне длин волн – от ультрафиолетового до инфракрасного (210-1100 нм) и исследовать окрашенные и бесцветные растворы в узкой зоне спектра, на участке максимального поглощения монохроматического потока света.

В основе абсорбционной спектрофотометрии лежат общие принципы способности веществ поглощать световую энергию по законом Бугера-Ламберта и Бера: D = k c d;

где D – оптическая плотность раствора;

k – молярный коэффициент поглощения (экстинкция), который равен оптической плотности 1 М раствора при толщине слоя в 10 мм;

с – концентрация раствора, моль/л;

d – толщина слоя жидкости, см.

Электрофорез

Явление электрофореза – это перемещение заряженных частиц в электрическом поле.

Поведение частицы в электрическом поле описывается тремя основными характеристиками: скоростью движения частицы v, электрокинетическим потенциалом  и электрофоретической подвижностью U. -потенциал прямо пропорционален свободному (не скомпенсированному ионами среды) заряду частицы (Q) и обратно пропорционален ее радиусу (r). Скорость заряженной частицы прямо пропорциональна -потенциалу. Электрофоретическая подвижность U равна отношению скорости частицы к напряжению электрического поля.

где Е – напряженность электрического поля, В/см;

– диэлектрическая постоянная среды,

Наиболее часто метод используют для аналитических целей – для разделения смеси заряженных веществ на фракции с последующим качественным и количественным их определением. Таким способом удается разделить, например, белки сыворотки крови на 5 фракций: альбумин и 4 фракции глобулинов. Эту задачу часто решают в клинической биохимии, так как соотношение фракций закономерно изменяется при многих патологических процессах.

Метод подразделяется на фронтальный или свободный электрофорез (электрофорез в жидкой среде) и зональный или электрофорез в поддерживающих средах. В качестве поддерживающих сред применяются различные инертные пористые природные либо синтетические материалы: бумага, ацетилцеллюлоза, крахмал в виде влажных зерен и в виде геля, гель агара либо агарозы, полиакриламидный синтетический гель – ПААГ. Задача поддерживающей среды – стабилизировать жидкость, уменьшить диффузию, а в ряде случаев – создать дополнительный механизм разделения. Например, в некоторых вариантах метода разделение по электрофоретической подвижности можно сочетать с разделением по молекулярной массе (наилучшим образом это достигается в ПААГ).

Одной из высокоразрешающих разновидностей метода является диск-электрофорез (от английского «discontinuos» — прерывистый, неоднородный). В этом методе движение молекул проходит вначале через концентрирующий крупнопористый гель, где разделяемая смесь концентрируется благодаря движению между 2-мя сортами ионов. Движущиеся впереди пробы ведущие ионы (принадлежат сильному электролиту) и находящиеся позади пробы замыкающие ионы (принадлежат слабому электролиту) создают разную напряженность поля по обе стороны зоны, занятой пробой. Вследствие этого «фронт» пробы тормозится, а «тыл», напротив, подгоняется. Таким путем достигается эффект концентрирования. Затем проба переходит в разделяющий гель с иным значением рН буферного раствора. Вследствие изменения рН (а значит, и степени диссоциации слабого электролита) замыкающие ионы опережают пробу, которая перемещается теперь на фоне замыкающих ионов — оказывается в однородной по рН мелкопористой среде. В этом втором, разделяющем геле происходит обычный электрофорез. Повышение разрешающей способности метода достигается за счет того, что перед разделением проба концентрируются в виде очень узкой стартовой зоны, и таким образом удается разделить даже вещества, мало отличающиеся друг от друга по свойствам.

Хроматография

Хроматографические методы основаны на динамическом раз­делении смеси веществ. Общий принцип хроматографии состоит в том, что непрерывный поток подвижной фазы, содержащей анализируемый образец, направленно проходит через стационарную фазу, которая в зависимости от своей природы, взаимодействует в различной степени с компонентами образца.

Распределение соединения между двумя несмешивающимися фазами определяется коэффициентом распределения, который для каждого конкретного вещества в системе из двух фаз при данной температуре постоянен и выражается отношением концентрации вещества в подвижной фазе к его концентрации в стационарной фазе. Фазы для хроматографического разделения выбирают так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси в них были различными.

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы хроматографические методы делят на газовую и жидкостную хроматографию; в зависимости от геометрической формы стационарной фазы – на колоночную и плоскостную (бумажную или тонкослойную).

В зависимости от механизма разделения веществ выделяют следующие виды хроматографии:

Адсорбционная хроматография основана на различной адсорбируемости компонентов разделяемой смеси на поверхности раздела фаз. Эти различия связаны главным образом с различиями в дипольных моментах (в полярности) разделяемых веществ, а также подвижной и неподвижной фаз хроматографической системы. Так, из полярной подвижной фазы на неполярном адсорбенте лучше адсорбируются неполярные вещества. Примером неполярного адсорбента может служить активированный уголь, сажа; полярного – окислы металлов, гидроокиси, некоторые соли, силикагель, полисахариды.

Абсорбционная или распределительная хроматография основана на различной абсорбируемости (поглощении всем объемом стационарной жидкой фазы, растворимости в ней) компонентов разделяемой смеси. В основе метода также лежит соотношение дипольных моментов разделяемых веществ и компонентов хроматографической системы. Примером распределительной хроматографии может служить разделение аминокислот в системе бутанол-вода либо фенол-вода. Стационарная полярная фаза – вода — удерживается инертным пористым твердым телом – бумагой, силикагелем и т.п.. Бутанол – неполярная подвижная фаза содержит компоненты разделяемой смеси и движется относительно воды, удерживаемой твердой пористой подложкой.

Хемосорбционные методы основаны на использовании хемосорбции. Наиболее распространенным из них является ионообменный метод, в котором используются различия в константах диссоциации разделяемых веществ-электролитов. Разделяемые вещества в виде катионов или анионов обратимо обмениваются на катионы или анионы, содержащиеся в стационарной твердой фазе (катионите или анионите, соответственно). Подвижная фаза – полярный растворитель (обычно буферный или солевой водный раствор). В качестве твердого пористого тела, содержащего прикрепленные к нему обмениваемые ионы, служат природные или синтетические полимеры – ионообменные смолы (целлюлоза, декстран, агароза, полиакриламид, полистирол).

Гель-хроматография или молекулярно-ситовая хроматография основана на разделении веществ в соответствии с их размерами (молекулярными массами). В этом методе используются те же пористые тела, что служат основой для ионообменной хроматографии, но без прикрепленных к ним ионогенных групп. Материал стационарной фазы представляет собой сферические гранулы определенного размера, внутри которых имеются поры. Размер пор также стандартен и выбирается так, чтобы обеспечить хорошую разрешающую способность метода. Наиболее крупные молекулы не могут проникнуть во внутренние мелкие поры и передвигаются только по промежуткам между гранулами. Они идут с наибольшей скоростью. Более мелкие частицы движутся с разными скоростями, в зависимости от того, какая доля объема внутренних пор доступна для них в соответствии с их размерами. Медленнее всех движутся самые мелкие молекулы.

Аффинная хроматография. Метод основан на специфическом сродстве (affinity) некоторых биологически активных веществ друг к другу. Один из партнеров – аффинант – обездвиживают (иммобилизуют) на твёрдой пористой подложке, вместе с которой он образует стационарную фазу. Второй партнер содержится в подвижной фазе. Аффинная хроматография позволяет выделить его из смеси любой степени сложности. Так, при пропускании через крахмал был выделен из панкреатического сока только один из его компонентов – фермент амилаза, для которого крахмал является субстратом. Наиболее распространенные пары веществ: фермент и субстрат, фермент и ингибитор, фермент и кофермент, антитело и антиген, рецептор и сигнальная молекула, транспортный белок и транспортируемое им вещество, комплементарные друг другу нуклеотиды. В связи с чем аффинная хроматография широко используется для очистки антигенов и антител, гормонов, рецепторов, транспортных белков, ферментов и т.п.

Метод центрифугирования

Разделение и исследование веществ с помощью центрифугирования основано на разной скорости оседания (седиментации) в центробежном поле частиц, имеющих разную плотность, форму или размеры.

Коэффициент седиментации зависит от молекулярной массы и формы частицы, а также от плотности и вязкости среды выделения, что используется для определения молекулярной массы.

Простейшая задача центрифугирования заключается в отделении осаждённых веществ от растворов как этап выполнения аналитических работ. Например, отделение белков от других органических соединений после осаждения. Подбирая скорости центрифугирования и определенные среды выделения, можно избирательно осаждать разные клеточные структуры: ядра, митохондрии, лизосомы, рибосомы, эндоплазматический ретикулум.

Радиоизотопные методы

Основаны на способности нестабильных радиоизотопов испускать частицы или электромагнитное излучение, которые фиксируются специальными методами.

Основными преимуществами методов с применением радиоизотопных меток являются их чувствительность и возможность вводить метки в живой организм, что позволяет исследовать метаболические превращения, механизмы и скорости поглощения и переноса веществ в интактном организме, возраст биологических образцов.

Что входит в биохимический анализ крови

Содержание:

БАК или Биохимический анализ крови – это высокоинформативный метод лабораторный диагностики, способный дать общую картину состояния пациента для оценки работы всех внутренних органов и обмена веществ. Расшифровка биохимии позволяет врачу определить точную причину болезни и назначить правильное лечение.

Показания к проведению биохимического анализа крови

Исследование проводится на первой стадии диагностики любых соматических заболеваний любого профиля. Обязательным направление пациента на биохимию крови является при следующих жалобах и симптомах:

  • Регулярные сбои в работе пищеварения (тошнота, рвота, тяжесть в животе, вздутие, метеоризм, диарея или запор, изжога, неприятные ощущения в подреберье);
  • Устойчивые боли любой локализации (головные, мышечные, суставные, в области внутренних органов);
  • Дыхательные нарушения (непроходящий кашель, одышка, спазмы);
  • Сигналы от нервной системы (тремор конечностей, хроническая усталость, бессонница, головокружения и обмороки);
  • Сбои в работе мочеполовой системы (изменение запаха и цвета мочи, изменения частоты мочеиспускания, неприятные ощущения в процессе);
  • Сигналы со стороны сердечнососудистой системы (учащенное или редкое сердцебиение, высокое или низкое артериальное давление);
  • Слабость иммунитета, которая выражается в частых и долго не проходящих респираторных заболеваниях;
  • Патологические изменения кожных покровов и наличие на теле видимых опухолей;
  • Признаки эндокринных нарушений (непроходящая жажда или голод, резкое изменение веса, постоянное ощущение жара или холода).
Читайте также  Углерод, его химическое и биологическое значение

Как проводится забор крови на биохимический анализ

Исследуемый материал (до 5мл) для биохимии берется из локтевой вены. Венозная кровь несет в себе больше информации, т.к. проходит через все ткани организма и меняет свой состав в процессе циркуляции. Пробирку с кровью отправляют в лабораторию, где в специальном аппарате — биохимическом анализаторе – производится обширный анализ.

Как подготовиться к сдаче крови на «биохимию»?

Чтобы результаты были максимально точными, необходимо соблюдать правила подготовки к анализу крови на биохимическое исследование:

  • За двое суток перейти к щадящему рациону – исключить жирные, сладкие, острые, соленые, копченые блюда, а также отказаться от алкоголя, кофе и крепкого чая;
  • Накануне воздерживаться от любых стрессовых для организма процедур и мероприятий – бани и сауны, контрастного душа, тяжелых физических нагрузок;
  • Если идет курс приема медикаментов, обсудить с лечащим врачом, не повлияют ли они на результаты анализа;
  • За 6-12 часов до БАК нельзя принимать какую-либо пищу и курить. Пить разрешается только простую воду.

Расшифровка и данные нормальных показателей

Результатом анализа является заключение, которое как правило представляет собой таблицу о содержании химических веществ и биологических агентов в крови. В первой колонке указан показатель, во второй — выявленное значение, в третьей — диапазон нормы. Только специалист, оценивая показатели, может определить наличие нарушений в водно-солевом обмене, выявить воспалительные процессы и инфекции, а также оценить состояние работоспособности всех органов пациента.

Что касается нормальных показателей, то данные для взрослых выглядят так:

Анализ Мужчины Женщины
Общий белок 64-84 г/л. 64-84 г/л.
Гемоглобин 130-160 г/л 120-150 г/л.
Гаптоглобин 150-2000 мг/л 150-2000 мг/л
Глюкоза 3,30-5,50 ммоль/л. 3,30-5,50 ммоль/л.
Мочевина 2,5-8,3 ммоль/л. 2,5-8,3 ммоль/л.
Креатинин 62-115 мкмоль/л 53-97 мкмоль/л.
Холестерин 3,5-6,5 ммоль/л. 3,5-6,5 ммоль/л.
Билирубин 5-20 мкмоль/л. 5-20 мкмоль/л.
АлАТ (АЛТ) до 45 ед/л. до 31 ед/л.
АсАТ (АСТ) до 45 ед/л. до 31 ед/л.
Липаза 0-190 ед/л. 0-190 ед/л.
Альфа-амилаза 28-100 ед/л. 28-100 ед/л.
Панкреатическая амилаза 0-50 ед/л. 0-50 ед/л.

Расшифровка основных показателей БАК

Общий белок. Биохимическое исследование крови определяет суммарную концентрацию различных белков, которые состоят из аминокислот. Белок принимает активное участие процессах свертывании, переработки и транспортировки питательных веществ в органы и ткани.

Гемоглобин. Этот специфический белок из системы эритроцитов отвечает за перемещения кислорода в организме

Гаптоглобин. Белок плазмы крови, который связывает гемоглобин и отвечает за сохранение железа в организме. Также участвует в контроле местных воспалительных процессов.

Глюкоза. Важный компонент, который отвечает за углеводный обмен. Ее содержание в артериальной крови всего выше, чем в венозной.

Мочевина. Этот основной продукт распада белков, в которой ненужный организму азот удаляется с мочой.

Креатинин. Это, как и мочевина, конечный продукт белкового обмена. Содержание креатинина в крови зависит от пола, возраста, мышечной массы.

Холестерин. Компонент жирового обмена, который также участвует при построении мембраны клетки и синтезе витамина D и половых гормонов. Другое название – холестерол. Различают — общий холестерин, холестерин липопротеинов с низкой плотностью (ЛПНП) и высокой плотностью (ЛПВП).

Билирубин. Продукт распада гемоглобина, токсичное вещество двух видов: прямой и не прямой. Они образуют «общий» и норма при расшифровки биохимического исследования крови указывается именно для него.

АлАТ (АЛТ). Аланинаминотрансфераза – это фермент содержат клетки печени, почек и сердца, поэтому его наличие в крови говорит о разрушении клеток этих органов.

АсАТ (АСТ). Аспартатаминотрансфераза — клеточные ферменты, которые участвуют при обмене аминокислот и содержатся в клетках печени сердца и почек.

Липаза. Фермент, способствующий расщеплению жиров.

Амилаза. Она занимается расщеплением углеводов из пищи и обеспечивает их переваривание. Различают альфа-амилазу (диастазу) и панкреатическую амилазу.

Важно помнить, что оценить результаты исследования крови, расшифровать биохимический анализ, поставить диагноз и назначить лечение может только специалист!

Где сдать кровь на биохимию в СВАО

Сдать кровь для биохимического анализа, вы можете в любой клинике, которая имеет лабораторию и необходимые инструменты для проведения исследования. «Поликлиника «ПрофиМед» в двух шагах от метро Отрадное (Москва, СВАО) с 2008 года работает в сфере частных медицинских услуг и имеет собственную лабораторию и штат высококвалифицированных специалистов.

Биохимическое исследования крови – значение и важность

Если Вы сами не решите следить за своим здоровьем, то никто не сделает это за Вас. На сегодняшний день Вы можете регулярно получать точные и информативные данные, по которым легко наблюдать за изменениями своего здоровья, чтобы вовремя принять меры. Самый простой и эффективный способ объективного наблюдения за здоровьем человека, который доступен каждому и не занимает много времени, это биохимический анализ крови.

Кому и когда нужно делать биохимический анализ крови?

Проводить такое исследование желательно ежегодно, чтобы иметь возможность сравнить новые результаты с прошлыми, и обсудить с врачом возможности коррекции состояния с помощью лекарств, изменения питания или образа жизни. Регулярно делать биохимический анализ крови следует с 35-40 лет. Тем, кто страдает хроническими заболеваниями печени, почек, легких и т.д. можно начинать делать исследования крови в более раннем возрасте. То же самое касается и людей, ведущих нездоровый образ жизни (переедание, гиподинамия, алкоголизм), а также пациентов, вынужденных принимать лекарственные препараты в течение длительного срока (в том числе оральные контрацептивы, гипотензивные средства, цитостатики, антибиотики, стероиды).

О чем говорят результаты биохимического анализа крови?

Данное исследование позволяет получить подробную информацию о состоянии и правильности работы основных систем организма и их ключевых органов.

Информацию об обмене веществ и функции печени предоставляют ферменты печени (АЛТ ,АСТ), фракции билирубина, общий белок, щелочная фосфатаза (ЩФ) и лактатдегидрогеназа (ЛДГ). По фракциям билирубина можно определить наличие нарушений оттока желчи и их примерную причину. По уровню АЛТ и АСТ врач сможет судить не только о состоянии печени, но также о повреждении сердечной мышцы (о наличии инфаркта миокарда и времени его возникновения) и о состоянии скелетных мышц.

Информацию о функциях почек дают такие показатели как креатинин, мочевина и мочевая кислота. Увеличение мочевой кислоты в крови может привести к точечным высыпаниям, похожим на аллергическую реакцию, а отложение кристаллов мочевой кислоты в суставах приводит к развитию тяжелого и очень неприятного заболевания – подагры. Повышенная концентрация креатинина в крови может указывать не только на проблемы с почками, но также на повреждение большого объема ткани мышц и на гиперфункцию щитовидной железы. Снижение содержания железа в крови требует проверить организм на злокачественные образования и анемии различного происхождения.

Липидограмма, которая отражает баланс между разными производными холестерина в крови, помогает определить риски появления атеросклероза сосудов, болезней сердца и печени (жировой гепатоз).

Биохимический анализ крови обнаруживает повышенный уровень глюкозы и позволяет вовремя предпринять меры по его снижению, до того как разовьется сахарный диабет второго типа. Предупредить развитие диабета действительно можно при соблюдении специальной диеты с ограничением сладкого, рекомендованной врачом.

Повышенный С-реактивный белок в биохимическом анализе крови помогает выявить скрытые воспалительные процессы в организме, что имеет большое значение для дифференциальной диагностики и определения плана дальнейшего лечения.

Биохимический анализ крови отражает водно-электролитный баланс в организме. Концентрация ионов калия и магния позволяет объяснить и спрогнозировать состояние сердца, сосудов и мышечной ткани. Низкий уровень калия в крови может вести к появлению таких симптомов, как перебои в работе сердца, спазм мышц голеней. От уровня магния зависит состояние нервной системы и артериальное давление. Иногда повышение употребления магния с помощью правильного питания может нормализовать высокое артериальное давление и стабилизировать состояние нервной системы. Повышенная концентрация ионов натрия поможет обнаружить риск развития артериальной гипертензии, заподозрить обезвоживание организма либо болезнь надпочечников.

Состояние поджелудочной железы и признаки ее повреждения позволяет оценить альфа-амилаза крови. Уровень амилазы повышается при остром и хроническом панкреатите, а также при других патологиях поджелудочной железы, когда частично повреждаются ее клетки (например, при злокачественных опухолях, травмах живота).

Ориентируясь на полученные результаты анализов, врач может не только правильно назначить лечение, но и порекомендовать изменить питание. Результат принятых мер виден уже на следующем анализе крови, проведенном спустя несколько месяцев. При условии выполнения всех врачебных назначений можно серьезно понизить риски развития диабета, гипертонии, инфарктов и инсультов, печеночной и почечной недостаточности, желчнокаменной болезни.

Чем может помочь биохимический анализ крови?

Изучение изменений определенных биохимических показателей крови дают врачу и пациенту следующие возможности:

  • Оценить правильность и полноценность функций внутренних органов;
  • Определить основные факторы риска для здоровья и спрогнозировать наиболее вероятные болезни и примерные сроки их появления и развития;
  • Уточнить диагноз или впервые обнаружить имеющуюся проблему со здоровьем;
  • Наблюдать в динамике за течением хронических заболеваний;
  • Оценивать эффективность лечебных процедур через определенные промежутки времени и в соответствии с результатом изменять назначения;
  • Определить причину некоторых патологических состояний, что облегчает выбор подхода к лечению.

Преимущества биохимических исследований крови:

  • Быстрое получение результатов;
  • Возможность оценить комплексно состояние организма, а также его отдельных систем и органов;
  • Доступность процедуры, практически полное отсутствие рисков и противопоказаний на ее проведение.

Биохимический анализ крови – это простой, доступный и эффективный инструмент, помогающий бороться за здоровье и долголетие. Возьмите в свои руки заботу о себе и не позволяйте болезням перехватить инициативу!

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: